在液相色譜儀系統分析過程中，有沒有遇到過色譜峰前延現象？為什么有時候同一個樣品減小進樣量色譜峰就變的很好看？日常的分析工作中，我們通常將更多精力集中在流動相和儀器方法的選擇上，忽視了樣品進樣溶劑的重要性。如果溶劑選擇不當則會產生“溶劑效應”，使我們在定性和定量分析中產生誤判，影響分析結果。
因此，了解“溶劑效應”產生的原因及掌握避免“溶劑效應”的基本方法對我們分析工作者是十分必要的。今天就跟大家分享一下，液相色譜儀分析過程中“溶劑效應”的那些事。
什么是溶劑效？
溶劑效應的概念
通常情況下對于溶劑效應的理解為稀釋劑溶劑強度大于流動相時造成色譜峰變形的現象。如用純乙腈溶解樣品，注入流動相為乙腈-水（18:82）的反相系統中，會造成峰分叉或拖尾的結果。但是這種概念不能解釋實踐中其他由稀釋劑導致的色譜行為異常現象，如溶出曲線研究中pH6.8溶出介質的溶出樣品主峰峰型異常、或加入SDS助溶后峰分叉等情況，這些情況中稀釋劑的溶劑強度并不一定大于流動相，但是卻發生了色譜行為異常的現象。
鑒于許多由稀釋劑導致的色譜行為異常現象不能用目前的溶劑效應進行解釋，筆者認為有必要將溶劑效應的概念進行重新闡述：溶劑效應，是指由于供試品中特定組分在稀釋劑與流動相中所處狀態的差異對色譜行為的不利影響。如果這種不利影響較為嚴重，則可能造成明顯的色譜行為異常，如峰分叉、拖尾等。
產生溶劑效應的圖
溶劑效應的產生過程解析
第一階段：樣品剛被注入系統，進入色譜柱后，流動相氛圍中的目標物以正常速度被洗脫。因強溶劑洗脫，移動速度快，樣品在空間上開始慢慢分裂。
第二階段：在一定時間內，溶劑氛圍中的目標物移動始終快一些，前后兩部分距離擴大。但移動快的目標物所處氛圍逐漸被流動相稀釋(注：因為溶劑和流動相均不保留)，其移動速度會逐漸降至正常流速。直到前面目標物的氛圍完全被流動相替代，前后兩部分的距離穩定下來。因而，樣品溶劑與流動相洗脫強度差距越大，兩部分目標物最終的距離拉的越大。
第三階段：所有目標物在色譜柱中正常移動，但分裂已不可逆轉。
經過檢測器，同一目標物給出了兩個色譜峰。其中進柱前即擴散進入流動相的那部分目標物組成了后面的色譜峰，它的保留時間與目標物的真實保留時間基本吻合。
簡單概括，強洗脫溶劑不均衡地參與了目標物的洗脫，使色譜峰保留時間整體提前，而樣品在柱前的不充分擴散導致了峰形扭曲。這種影響輕則導致峰展寬，嚴重時甚至導致峰裂分，給定性定量帶來災難。
產生溶劑效應的原因
1、溶劑強度
在反相色譜系統中溶劑強度的順序為水（最弱）＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜四氫呋喃＜丙醇＜二氯甲烷（最強）。溶解樣品的溶劑強度大于該樣品出峰時流動相強度，樣品溶劑可以看成流動相的一部分，一部分樣品溶解于溶劑中會被迅速洗脫出色譜柱，而一部分樣品溶解于流動相，被流動相洗脫出，這樣會造成色譜峰的展寬或者分叉。
2、進樣體積
當進樣體積較小時，擴散至流動相中的溶質占大多數，且擴散在很短時間內完成，因此峰形與用流動相直接溶解樣品無大差異。隨著進樣的體積增大，留在溶劑本身里的溶質的量逐漸增大，當進樣體積增大到一定數量，留在溶劑里的溶質的量變得不可忽略，在色譜圖上就表現為色譜峰的分叉、拖尾等。
3、溶劑與流動相的兼容性
有時，當我們使用流動相或流動相中的有機相無法直接溶解樣品，這時很多小伙伴會選擇使用氯仿、甲苯等能溶的溶劑，甚至DMSO這樣的“萬能溶劑”來溶解樣品。這樣進樣的結果是溶劑與流動相不兼容，溶質難以在流動相中擴散。又如，在做參比制劑的溶出曲線中，溶媒中經常加入表面活性劑。而帶有表面活性劑的溶劑進樣后，由于溶質在含有表面活性劑的溶劑中的分配系數與在流動相中的分配系數存在較大差異，就會導致峰形的問題，甚至保留時間的漂移。
4、電離狀態
電離狀態的差異主要由溶劑和流動相各自的pH差異引起。我們都知道，在反相體系中，目標化合物的存在狀態不同，保留行為會有明顯的差異，而存在狀態就取決于目標化合物在不同pH體系內的電離狀態。若樣品在溶劑和流動相中電離狀態差異較大，樣品溶液在接觸流動相的過程中，來不及緩沖至流動相中的電離狀態，這個時間如果較長，就容易表現為保留時間發生錯位或峰形變形，如下圖的案例。
（流動相為pH 3.0緩沖鹽。綠色譜圖為對照品，另外三個譜圖樣品的溶劑從下至上分別為0.1%磷酸、純化水、pH 3.0流動相）
5、柱前管路
柱前管路內徑越大、管路越長，越利于目標物向流動相擴散，而且使用更粗的管路比更長的管路有效(注：假設死體積相同)。雖然粗的管路加劇了等度條件下的柱外展寬，對柱效有危害，然而相較于峰分叉的危害而言，前者尚能接受。
這就是為什么有時候會發現，HPLC的液相（管路死體積大）比UPLC的液相（管路死體積小）色譜峰型好。
如何解決溶劑效應
1、溶劑強度
對于這一最普遍的溶劑效應，解決辦法即調整稀釋劑或流動相，使二者洗脫能力接近，或稀釋劑洗脫能力稍低于流動相都是可以的。一般情況下，為避免溶劑強度差異導致的溶劑效應，反相色譜中較為穩妥的做法是稀釋劑中有機相比例和流動相相當，必要時可略高于流動相，但應當據其評估其溶劑效應風險。
2、進樣體積
常規情況下，為了保證峰形，我們的進樣體積都控制在5-20μL，盡量不要超過25μL。如果不能做到減少至合適的進樣體積，為了得到較好的峰形，應盡量選擇與流動相比例相同或接近的溶劑。
3、溶劑與流動相的兼容性
使得溶劑與流動相能較好地兼容，目前辦法有兩個：
一是若流動相或流動相中的有機相無法直接溶解樣品，則用可以溶解樣品的溶劑溶解成高濃度儲備液，然后用流動相稀釋至所需濃度；
二是在流動相中加入同樣的助溶劑或表面活性劑，或提高有機相的比例。
4、電離狀態
電離狀態的差異許多情況下會表現為保留時間的漂移或不穩定。可以通過將樣品溶液的pH調節至與流動相一致，或增大流動相的緩沖能力來改善。
5、柱前管路
對于梯度洗脫而言，在不影響分離度的情況下，可以改用較粗內徑的柱前管路。(注意：若是等度洗脫，此方法會降低柱效；若是梯度洗脫，基本不影響柱效)。