1 引 言
中藥廣泛應(yīng)用于疾病的預(yù)防和治療。快速分離純化技術(shù)對于理解中藥復(fù)雜的物質(zhì)基礎(chǔ)、控制中藥質(zhì)量和發(fā)現(xiàn)潛在活性物質(zhì)具有重要意義，也是目前中藥研究的熱點(diǎn)問題之一。作為分析型高效液相色譜系統(tǒng)的延伸，高壓制備液相系統(tǒng)能夠在保證樣品分離度的前提下，大幅度提高載樣量，從而快速獲得高純度的目標(biāo)化合物。目前，高壓制備液相在中藥、生物藥、生物制品、食品等樣品的分離研究中得到廣泛應(yīng)用。
然而，由于中藥體系復(fù)雜，各個(gè)組分間含量差異大，且很多物質(zhì)極性相似、性質(zhì)相近，單純使用高壓制備液相色譜進(jìn)行一維分離純化難以滿足多組分復(fù)雜樣品的分離要求。對此，研究者在高壓制備液相色譜的基礎(chǔ)上，組合不同的分離技術(shù)，構(gòu)建了多維制備色譜系統(tǒng)，有效解決了復(fù)雜體系樣品分離純化的難題。目前，基于高壓制備液相 色譜的多維色譜系統(tǒng)已應(yīng)用于中藥、食品等研究工作中。本文介紹了基于高壓制備液相的多維色譜系統(tǒng)的基本原理和關(guān)鍵技術(shù)，并綜述了其在中藥分離純化中的應(yīng)用。
2 高壓制備液相系統(tǒng)的多維色譜技術(shù)
由
于天然產(chǎn)物、中藥及代謝產(chǎn)物等樣品的復(fù)雜性，傳統(tǒng)的一維色譜在一次運(yùn)行中，常常受峰容量（Peak capacity）和分辨率的限制，不能滿足分析和分離的需要。根據(jù)Giddings等的研究，多維分離模式的峰容量應(yīng)為其構(gòu)成的各個(gè)一維分離模式的峰容量的乘積，這使得在一定時(shí)間內(nèi)從色譜柱中洗脫出來并達(dá)到一定分離度的色譜峰的數(shù)量大大增加，多維色譜（Multidimensional chromatography， MDC）技術(shù)也因此而得到了迅速發(fā)展。高壓制備液相的多維色譜是在高壓制備液相色譜的基礎(chǔ)上，通過閥門控制或離線再進(jìn)樣操作，結(jié)合其它分離機(jī)制或分離模式的色譜技術(shù)而形成的一項(xiàng)能對復(fù)雜樣品實(shí)現(xiàn)高容量分離純化的新技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)樣品不同組分在一次操作中的多次分離。它不僅能提高色譜體系的峰容量和正交性，還能降低色譜峰之間峰重疊，使得多組分樣品、含量差異大樣品，性質(zhì)相似樣品的分離制備成為可能。
2.1 分離模式
根據(jù)兩維間洗脫餾分是否直接進(jìn)行連續(xù)性分離，可將多維色譜技術(shù)分為離線模式和在線模式。離線模式指洗脫餾分不直接進(jìn)行連續(xù)性分離，這種操作模式溶劑選擇性廣，對儀器要求不高，峰容量大，但步驟繁多，自動(dòng)程度不高，耗時(shí)耗力，樣品損失較多。對應(yīng)于離線模式，在線模式是通過儀器系統(tǒng)自身對樣品進(jìn)行捕獲、富集，最終實(shí)現(xiàn)多次分離的模式，這種模式自動(dòng)化程度高，連續(xù)性強(qiáng)，但對溶劑的兼容性要求較高。
二維以上的多維制備色譜通常結(jié)合了離線模式與在線模式，這種多維制備色譜更適用于性質(zhì)相近、結(jié)構(gòu)相似的組分的分離純化。然而，多維的分離操作會導(dǎo)致樣品的損失量增大，因此在分離分析過程中需要確保足夠的樣品量。
2.2 制備色譜柱
與分析型色譜柱相比，制備型色譜柱的上樣量和流速都可以提高3至4個(gè)數(shù)量級，甚至更高。制備色譜雖然不是分析色譜的簡單放大，但是兩者可以通過線性放大系數(shù)關(guān)聯(lián)起來。線性放大的基本假設(shè)是分析色譜系統(tǒng)和制備色譜系統(tǒng)的化學(xué)性質(zhì)、傳質(zhì)過程都保持不變，而進(jìn)樣量、流量、收集體積等乘以線性放大系數(shù)，線性放大系數(shù)即為制備色譜柱截面積和分析色譜柱截面積之比。
色譜柱的選擇要根據(jù)樣品的性質(zhì)，對疏水性樣品可以選擇反相色譜柱，親水性樣品可選正相色譜柱和親水色譜柱，生物大分子可選擇離子交換色譜柱，碳水化合物可用疏水作用色譜柱，無機(jī)離子可使用離子色譜柱，合成聚合物可采用凝膠色譜柱，立體異構(gòu)可采用環(huán)糊精固定相，而外消旋體樣品則可以考慮手性色譜柱。在實(shí)際操作過程中，可以根據(jù)樣品、色譜柱以及流動(dòng)相的特點(diǎn)，合理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對樣品進(jìn)行純化。Zhang等通過以NaHCO3緩沖液和0.035%三氟乙酸作為pH調(diào)節(jié)劑，根據(jù)在不同pH值條件下，色譜柱和樣品在流動(dòng)相選擇性不同，從復(fù)雜樣品中純化出33種化合物單體。Wei等采用苯基己基色譜柱，這種色譜柱在乙腈作用下對三酰基甘油具有疏水作用，而在甲醇作用下對三酰基甘油具有ππ鍵相互作用，實(shí)驗(yàn)成功從不同食用油中分離純化出多種化合物單體。
2.3 在線多維色譜關(guān)鍵技術(shù)
多維的分離雖然為藥物研究帶來很大便利，然而如何解決不同維度溶劑體系兼容性問題，如何構(gòu)建轉(zhuǎn)換接口以實(shí)現(xiàn)兩維溶劑體系的轉(zhuǎn)換，以及如何利用制備色譜柱等因素設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對復(fù)雜樣品進(jìn)行有效的分離純化仍是影響多維色譜發(fā)展的核心問題。
2.3.1 分離體系兼容性 影響分離體系兼容性的最主要因素是不同維度之間溶劑與溶劑、溶劑與樣品兼容性問題。只有對兩者進(jìn)行合理的匹配，才可能實(shí)現(xiàn)最佳的分離效果。可以通過以下方法解決溶劑體系兼容性問題：
（1）使用兼容性溶劑 使用兼容性溶劑是解決該問題最簡單、最直接的辦法。陳芳芳根據(jù)分子排阻色譜和反相色譜不同的分離機(jī)理，采用Sephadex LH20中壓柱作為第一維，以C18制備色譜柱作為第二維，構(gòu)建了具有正交性的全二維在線中壓液相×制備型高效液相色譜的制備液相色譜系統(tǒng)（MPLC×prepHPLC），兩維都以甲醇/水為流動(dòng)相，樣品在經(jīng)第一維洗脫分離后儲存在富集柱上，然后被交替送入第二維制備液相色譜柱進(jìn)行進(jìn)一步分離，在經(jīng)歷了兩種分離機(jī)制的色譜柱分離后，獲得18種純化的化合物單體。
2）在線稀釋 在進(jìn)行色譜分離時(shí)，可以采用初始流動(dòng)相作為樣品溶劑來避免樣品、溶劑以及流動(dòng)相不兼容的問題。因而可以將第一維餾分切割成小體積，與第二維流動(dòng)相混合后進(jìn)入第二維色譜柱中。Liu等通過將一維反相色譜柱洗脫的餾分進(jìn)行高有機(jī)相在線稀釋，然后經(jīng)定量環(huán)到達(dá)第二維進(jìn)行親水色譜柱分離，成功構(gòu)建了在線RP/HILIC二維液相系統(tǒng)。這種系統(tǒng)在第一維反相色譜中可以有效對極性小的物質(zhì)進(jìn)行分離，在第二維親水色譜中能有效對極性大的物質(zhì)進(jìn)行分離，適合各成分間極性范圍廣的物質(zhì)的分離。
（3）在線脫溶劑 可以通過萃取或過濾的方式實(shí)現(xiàn)在線脫溶劑，但這種方法由于萃取不徹底或者洗脫不徹底，造成一定的溶劑殘留，影響下一維分離。也可以通過控制樣品捕集器的溫度或真空度實(shí)現(xiàn)。田宏哲等通過設(shè)計(jì)特定的樣品環(huán)，使第一維的餾分在樣品環(huán)中（90℃環(huán)境下）真空濃縮，第二維流動(dòng)相經(jīng)過該特定樣品環(huán)后將濃縮的樣品帶入到第二維色譜柱中進(jìn)行分離，成功實(shí)現(xiàn)了6種多環(huán)芳香烴化合物的分離。在線脫溶劑是需要考慮的樣品的穩(wěn)定性、耐熱性等因素，如果樣品耐熱性強(qiáng)、穩(wěn)定性好，采用高溫真空濃縮會提高脫溶劑效率。
2.3.2 接口轉(zhuǎn)換技術(shù) 如果各維溶劑體系兼容，理論上可以將上一維樣品直接進(jìn)入到下一維中，但是制備液相流速較大，如果直接進(jìn)樣可能會導(dǎo)致下一維進(jìn)樣體積過大，影響分離效率。所以需要通過設(shè)計(jì)樣品轉(zhuǎn)換接口對上一維樣品進(jìn)行在線處理來解決這個(gè)問題。對于不兼容性溶劑體系，就更需要依賴這種轉(zhuǎn)換接口實(shí)現(xiàn)在線分離。捕集柱閥切換接口、樣品環(huán)閥切換接口、平行柱閥切換接口是常見的3種接口轉(zhuǎn)換技術(shù)。
捕集柱閥切換接口技術(shù)是在不同維度間形成樣品捕集過程，對上一維餾分進(jìn)行在線的捕集，已達(dá)到降低第一維切割組分的溶劑體積或者改變?nèi)軇┙M成比例，然后通過閥切換技術(shù)，使用強(qiáng)洗脫劑將樣品進(jìn)樣到下一維。在這種模式下，捕集柱對切割餾分的保留能力大于第一維色譜柱，且餾分在第二維流動(dòng)相洗脫條件下易于解吸，以確保餾分的回收率。因此，根據(jù)樣品以及流動(dòng)相特點(diǎn)選擇適合的捕集柱至關(guān)重要。Qiu等在對河套大黃化學(xué)成分分離純化的研究中，通過對3款不同型號色譜柱進(jìn)行色譜柱大小、稀釋比例、柱直徑與柱長比值等因素的比較，選擇ODS Prepcolumn為捕集柱（15 mm×30 mm i.d.）， 硅膠填充中壓制備柱為第一維，將一維餾分濃縮在特定的固相捕集柱上后，再通過閥切換技術(shù)使流動(dòng)相將樣品進(jìn)入到第二維色譜柱中，分離純化出了25種化合物單體。
樣品環(huán)閥切換接口技術(shù)的環(huán)接口通常由兩個(gè)相同體積的樣品環(huán)和多通切換閥組成，第一維色譜柱的洗脫產(chǎn)物分別交替的儲存在樣品環(huán)中，第二維的泵再將儲存環(huán)里的樣品帶入第二維進(jìn)行分離。使用這種接口模式時(shí)，第一維的流速較小，且要求各維流動(dòng)相具有很好的兼容性，對樣品有很好的溶解性。Qiao等通過兩個(gè)樣品環(huán)切換，將第一維餾分交替儲存到樣品環(huán)中，并且通過第一維儲存在樣品環(huán)中的流動(dòng)相比例，實(shí)時(shí)調(diào)節(jié)第二維初始流動(dòng)相比例，以降低溶劑兼容性問題的影響，大大提高了色譜體系的峰容量。平行柱閥切換接口技術(shù)的原理其實(shí)與樣品環(huán)閥切換接口模式很類似，不同的是它沒有樣品環(huán)作為中間儲備環(huán)節(jié)，第一維樣品直接交替轉(zhuǎn)移到第二維兩根或者多根色譜柱柱頭，在第二維柱頭實(shí)現(xiàn)譜帶壓縮或者樣品富集，當(dāng)其中的一根色譜柱正在進(jìn)樣時(shí)，第二根色譜柱正在進(jìn)行洗脫。Machtejevas等對血濾液中多肽類化合物的分析中，通過一維離子交換色譜柱平行串聯(lián)4根反相色譜柱，在96 min內(nèi)分離出超過1000個(gè)色譜峰。
由于分析型液相色譜在樣品載樣量、流速等方面都小于制備色譜，因而它更容易對樣品進(jìn)行稀釋、濃縮、轉(zhuǎn)移，更容易實(shí)現(xiàn)在線操作，因而接口轉(zhuǎn)換技術(shù)在分析領(lǐng)域發(fā)展相對較快。但是，只要合理選擇流動(dòng)相和色譜柱，構(gòu)建合適的在線接口解決溶劑兼容性問題，就可以實(shí)現(xiàn)對樣品的在線多維分離制備。
3 高壓制備液相色譜的多維色譜在中藥研究中的應(yīng)用
高壓制備液相色譜可以與不同色譜分離技術(shù)聯(lián)用，常見的聯(lián)用技術(shù)有傳統(tǒng)的柱層析法，凝膠滲透法、逆流色譜法以及超臨界萃取法等。高壓制備液相也可以通過與不同分離機(jī)制的色譜柱聯(lián)用對樣品進(jìn)行多維分離。
3.1 高壓制備液相色譜聯(lián)用柱層析法在中藥研究中的應(yīng)用
高壓制備液相色譜可以與傳統(tǒng)層析柱技術(shù)聯(lián)用。通過柱層析法對樣品進(jìn)行粗分離，然后將各餾分進(jìn)行濃縮、富集，通過這種操作，樣品各成分相對含量大大提高，雜質(zhì)峰減少，且可通過多次柱層析達(dá)到樣品純化的目的，有利于高壓制備液相進(jìn)行下一維分析。Zhang等通過低極性SP850大孔吸附樹脂對蛇竹石杉進(jìn)行粗分離，除去樣品中極性組分， 獲得粗萃取物，然后采用低壓C18柱繼續(xù)對樣品富集，最后采用高壓制備液相色譜分離，對粗餾分進(jìn)行分離純化，制備出了石杉堿A（純度99.1%）和石杉堿B（純度98.6%）。由于柱層析法自動(dòng)化操作不高，耗時(shí)耗力，且容易造成樣品污染，因而它與高壓制備液相難以實(shí)現(xiàn)在線聯(lián)用。
3.2 高壓制備液相色譜法聯(lián)用逆流色譜的多維色譜在中藥研究中的應(yīng)用
逆流色譜（Countercurrent chromatography，CCC）是利用不同物質(zhì)在所選擇的兩相溶劑中的分配系數(shù)不同，通過多次逆流分溶對物質(zhì)進(jìn)行分離。由于它不使用固相載體作固定相，因而克服了固相載體帶來的樣品吸附、損失、污染和峰形拖尾等缺點(diǎn)。高壓制備液相色譜通過與之聯(lián)用在中藥研究中得到了相對廣泛的應(yīng)用。
目前，大部分高壓制備液相與逆流色譜聯(lián)用大多采用離線模式。由于CCC樣品處理要求不高，上樣量大，在與制備液相聯(lián)用時(shí)通常作為第一維。Zhu等采用三維分離體系從北五味子中純化出6種木酚素單體，該方法首先通過AB8大孔吸附樹脂對北五味子醇提物進(jìn)行粗分離，然后采用高速逆流色譜對目標(biāo)餾分進(jìn)行第二維分離，最后通過高壓制備液相對目標(biāo)餾分進(jìn)行第三維分離。雖然這種方法操作復(fù)雜，但是通過組合不同分離機(jī)制色譜條件，整個(gè)色譜體系的峰容量得到了很大的提高，實(shí)現(xiàn)了對6種性質(zhì)相近的木酚素的分離。對應(yīng)于離線模式，在線模式在時(shí)間成本、勞動(dòng)成本等方面具有突出的優(yōu)勢。Liang等構(gòu)建一個(gè)在線二維色譜體系，以逆流色譜為第一維，當(dāng)檢測到目標(biāo)成分以后，六通閥將通路切換到第二維，當(dāng)?shù)谝粋€(gè)目標(biāo)峰全部進(jìn)入第二維之后，第一維保持原有流動(dòng)相比例不變，且流動(dòng)相不洗脫，泵在第二維高壓制備液相工作，對第一個(gè)目標(biāo)峰進(jìn)行洗脫，洗脫完成后，第一維又開始工作，如此實(shí)現(xiàn)了對兩種抗氧化劑的純化，大大簡化了實(shí)驗(yàn)操作步驟。
3.3 高壓制備液相色譜自身結(jié)合的多維色譜在中藥研究中的應(yīng)用
通過相同或不同分離機(jī)制的色譜柱結(jié)合也可以實(shí)現(xiàn)多維色譜。正相（NP）、反相（RP）、體積排阻（SEC）、離子交換（IEX）等不同的液相色譜分離模式，由于分離機(jī)理的不同，分離選擇性也有很大差異。van Beek等首先通過硅膠柱層析（正相）對樣品進(jìn)行富集，除去樣品中雜質(zhì)，然后采用C18柱（反相）將銀杏葉中性質(zhì)差別較大的物質(zhì)進(jìn)行分離，對于多個(gè)目標(biāo)化合物的組分，進(jìn)一步采用銀色譜法（離子交換）對性質(zhì)相近組分進(jìn)行第二維分離，成功從銀杏葉中獲得了6種極性相似的銀杏酚酸單體。高壓制備液相色譜自身聯(lián)用也可以采用相同分離機(jī)制色譜柱，連續(xù)多次分離，Li等通過將相同的色譜柱進(jìn)行串聯(lián)建立循環(huán)制備液相，在檢測器未檢測到樣品信號前，柱通過閥切換技術(shù)使流動(dòng)相進(jìn)廢液，除去樣品中極性大的雜質(zhì)，檢測到樣品信號以后，再通過閥切換使目標(biāo)組分進(jìn)入下一個(gè)色譜柱，然后使在兩根色譜柱上多次循環(huán)分離，直至目標(biāo)組分完全分離，通過色譜峰信號一次收集所有餾分。串聯(lián)色譜柱，實(shí)際也就等同于增加了色譜柱長，增加理論塔板數(shù)，提高對物質(zhì)分離的能力。
4 總結(jié)與展望
與一維制備技術(shù)相比， 基于高壓制備液相的多維色譜技術(shù)能顯著提高色譜峰容量和選擇性， 分離純化能力強(qiáng)， 可以解決單一色譜分離模式難以解決的分離分析問題。多維在線分離模式的發(fā)展， 使得儀器自動(dòng)化程度大幅度提高， 降低了樣品的生產(chǎn)周期短以及生產(chǎn)成本。基于高壓制備液相的多維色譜制備技術(shù)已經(jīng)逐漸成為中藥研究中重要的分析工具。
多維制備因其大量、高速的特點(diǎn)， 使得它在實(shí)現(xiàn)高自動(dòng)化操作上面臨更大挑戰(zhàn)。接口技術(shù)、分離體系的兼容性問題仍然是其發(fā)展的關(guān)鍵性因素。在制備過程中， 如何自動(dòng)化、大批量的將分離餾分進(jìn)行濃縮富集， 快速獲得高純度目標(biāo)化合物， 也是目前亟需解決的問題之一。可以相信， 隨著人們的不斷深入探索和研究， 以高壓制備液相為基礎(chǔ)的多維色譜制備技術(shù)會成為現(xiàn)代藥物研究中更具貢獻(xiàn)力的技術(shù)。
